La même leçon, avec les figures en mouvement.
Conserver des souches
Pourquoi congeler une souche ?
Ce n'est pas une leçon dont tu as besoin à chaque brassin. Mais elle vaut une soirée le jour où tu as une souche que tu ne veux pas risquer de perdre — une levure sauvage bien capturée, une souche devenue difficile à trouver, ou tout simplement ta préférée.
1. Le cryoprotecteur
L'eau qui gèle sans protection forme des aiguilles de glace cristallines et coupantes. Elles traversent la membrane cellulaire et font éclater la cellule de l'intérieur — la levure ne meurt pas du froid, elle meurt de la glace.
Le glycérol résout le problème en pénétrant dans la cellule et en abaissant le point de congélation. Le liquide ne se fige alors pas en un bloc dur de cristaux, mais en une masse visqueuse et vitreuse, sans arêtes vives. Les structures internes de la cellule traversent tout l'hiver au congélateur sans dommage.
Le protocole utilise une solution de glycérol à 40 % mélangée 1:1 à de la levure épaisse, ce qui donne environ 20 % dans le tube fini — la concentration qui offre la meilleure survie cellulaire sans devenir toxique pour la levure.
2. Stériliser la solution
Mélange 40 ml de glycérol (50 g) + 60 ml d'eau dans une bouteille en verre — cela donne une solution de glycérol à 40 %. Visse le bouchon sans serrer.
Le glycérol est visqueux et reste collé à l'éprouvette. Pèse-le plutôt que d'en mesurer le volume : 1 ml de glycérol pèse environ 1,26 g.
Passe 15 minutes à 121 °C à l'autocuiseur et laisse refroidir à température ambiante, bouchon en place. Pas d'autocuiseur ? Fais bouillir la bouteille 20 minutes au bain-marie, bouchon desserré — protection plus faible, prends l'autocuiseur si tu en as un.
La solution se garde des mois au réfrigérateur, alors prépare toute la série d'un coup.
3. Remplir le cryotube
Stérilise les tubes à l'avance (à l'autocuiseur, vides, bouchon desserré) ou utilise des cryotubes stériles du commerce. Dévisse le bouchon et pose le tube dans un portoir — ne le tiens jamais à la main pendant le dosage.
Verse 0,5 ml de levure épaisse et 0,5 ml de la solution à 40 % — à parts égales, ce qui donne ces 20 pour cent. Un millilitre au total dans un tube de 2 ml : une bonne marge par rapport à la limite du protocole, deux tiers au maximum, car le liquide se dilate en gelant.
Retourne le tube plusieurs fois et laisse-le reposer 15 à 30 minutes à température ambiante. Le glycérol a besoin de ce temps pour pénétrer dans les cellules — sauter le repos revient à congeler des cellules sans protection.
Étiquette le tube avec la souche, la date et la génération, au marqueur résistant au froid. Un tube donne un réveil plus tard : compte donc 8 à 10 tubes par souche pour des années de réserve.
4. Le congélateur
Place les tubes au congélateur à −18 à −20 °C et n'y touche plus. Tout au fond et tout en bas, la température est la plus stable — jamais dans la porte.
Leur cycle de dégivrage fait osciller la température, et chaque oscillation reconstruit des cristaux de glace dans le tube. Un congélateur manuel, sans dégivrage automatique, vaut bien mieux — si tu n'as qu'un modèle sans givre, place les tubes dans une boîte isolante (sac isotherme, polystyrène) à l'intérieur du congélateur pour amortir les variations.
Compte plusieurs années de conservation à −18/−20 °C. Les −80 °C d'un laboratoire sont une tout autre catégorie (des décennies), mais un congélateur ménager ordinaire suffit largement pour une bibliothèque maison.
Étiquette bien la boîte — les tubes de glycérol ressemblent à de la nourriture, mais n'en sont pas.
5. Réveiller une souche
Sors un seul tube et referme le congélateur tout de suite — les autres ne doivent pas commencer à dégeler sur les bords.
Décongèle-le vite dans la main ou dans de l'eau tiède, juste jusqu'à ce que le contenu devienne liquide. Ne le laisse pas traîner et se réchauffer.
Verse tout le contenu dans un petit pied de cuve stérile — environ 100 ml de moût léger (1.020–1.030), à température ambiante. Pas de striage sur boîte : la levure capturée va directement en milieu liquide, où tu peux voir qu'elle est vivante.
Sois patient. Une culture congelée peut demander 24 à 72 heures avant que quoi que ce soit apparaisse — ne raye pas le tube trop tôt. Une fois partie, tu la montes comme n'importe quel pied de cuve.
Les cycles congélation-décongélation tuent la levure plus vite que tout le reste du processus. Si tu as de la réserve : congèle de nouveaux tubes la prochaine fois qu'une culture saine tourne de toute façon, avec le numéro de génération suivant sur l'étiquette.