La même leçon, avec les figures en mouvement.
Banque congelée au glycérol
Un bocal de slurry se garde deux semaines au frigo. Une gélose inclinée tient plus longtemps — mais elle doit être réensemencée au bout d'environ trois mois : la levure continue de vivre lentement au froid, et plus le temps passe, moins on peut être sûr que la souche soit encore la même (dérive génétique).
Le congélateur est la réponse quand tu veux garder une souche pendant des années. Le froid arrête le métabolisme — une culture congelée ne dérive pas, elle est à l'arrêt. Mais il lui faut un cryoprotecteur : de la levure nue qui gèle est déchirée par les cristaux de glace, alors que le glycérol pénètre dans les cellules et rend la glace inoffensive. Le résultat : une petite collection de tubes dont chacun est un point de départ prêt à l'emploi.
Considère la banque comme un investissement : tu passes une soirée à congeler, puis tu en sors une souche à la fois pendant des années.
Matériel
- Glycérol 99,5 % (pharmacie ou qualité alimentaire) — 50 ml durent très longtemps
- Tubes de congélation à bouchon vissé (cryotubes 1,5–2 ml), 8 à 10 par souche
- Bouteille en verre avec couvercle pour la solution de glycérol (100–250 ml)
- Autocuiseur
- Balance de précision ou éprouvette graduée
- Une culture de levure jeune et saine (starter terminé, gélose inclinée ou colonie)
- Désinfectant
- Étiquettes + marqueur résistant au froid
- Un congélateur à −18 / −20 °C, de préférence sans dégivrage automatique
Avant de congeler — quelle culture ?
- Congèle une culture jeune et saine : un starter frais qui vient de finir de fermenter, ou une culture repartie d'une gélose inclinée ou d'une colonie. C'est de la levure au sommet de sa forme que tu veux conserver.
- Ne congèle pas un gâteau de levure récolté sur une brasse terminée. Il est stressé et plein de trub — et tu serais coincé avec cette banque pendant des années.
- Fais un cold crash du starter, verse le moût et garde la slurry épaisse du fond — c'est elle qu'on mélange au glycérol.
- Prévois le nombre de tubes : un tube = un réveil. Un tube décongelé ne se recongèle jamais. 8 à 10 tubes par souche durent des années.
C'est ici que la technique stérile paie le plus. Une contamination congelée avec la levure accompagnera chaque culture future issue de ce tube.
Étape 1 — Prépare la solution de glycérol (40 %)
- Mélange 40 ml de glycérol (50 g) + 60 ml d'eau dans la bouteille = solution de glycérol à 40 %. Couvercle posé sans serrer.
- Passe 15 min à l'autocuiseur (121 °C). Laisse refroidir à température ambiante, couvercle en place.
- Pas d'autocuiseur ? Fais bouillir la bouteille au bain-marie 20 min, couvercle desserré. La garantie est plus faible — prends l'autocuiseur si tu peux.
- La solution se garde des mois au frigo : prépare toute la série d'un coup.
Le glycérol est visqueux et reste collé au verre doseur. Pèse plutôt que de mesurer un volume : 1 ml de glycérol ≈ 1,26 g.
L'autocuiseur doit refroidir de lui-même avant ouverture — ne le refroidis jamais à l'eau froide.
Étape 2 — Mélange et remplis les tubes
- Stérilise les tubes (à l'autocuiseur, vides, bouchons posés sans serrer) ou utilise des cryotubes stériles du commerce. Laisse refroidir.
- Mélange à parts égales slurry épaisse et solution à 40 % — tu arrives à environ 20 % de glycérol dans le tube, la plage standard pour une banque congelée.
- Remplis les tubes aux deux tiers maximum. Le liquide gonfle en gelant et peut faire éclater un tube plein.
- Retourne les tubes plusieurs fois et laisse-les 15 à 30 min à température ambiante. Le glycérol a besoin de ce temps pour pénétrer dans les cellules — sans ce repos, tu congèles des cellules sans protection.
- Étiquette chaque tube avec la souche, la date, la génération et l'origine (p. ex. « US-05, gélose inclinée, gén. 2 »). Petit mais lisible — l'écriture doit survivre au givre.
Tiens un registre de la banque : souche, date, tubes restants. Un tube sorti est rayé de la liste immédiatement.
Étape 3 — Congèle et conserve
- Mets les tubes au congélateur à −18 / −20 °C. Laisse-les tranquilles — aucune technique de refroidissement particulière n'est nécessaire à l'échelle domestique.
- Évite les congélateurs à froid ventilé (no frost). Leur cycle de dégivrage fait osciller la température, et chaque oscillation forme de nouveaux cristaux de glace dans les tubes. Un congélateur coffre à dégivrage manuel est bien meilleur. Si tu n’as qu’un congélateur no frost : mets les tubes dans une boîte isolée, un bloc de polystyrène ou une petite glacière, avec quelques pains de glace, tout au fond du congélateur. La masse autour des tubes amortit les oscillations.
- Range les tubes tout au fond et tout en bas, là où la température est la plus stable — pas dans la porte.
- Compte plusieurs années de conservation à −18/−20 °C. Les −80 °C du labo sont une autre catégorie (des décennies), mais un congélateur domestique suffit largement pour une banque maison. Ne t’y fie pas pour autant les yeux fermés : décongèle un tube témoin une fois par an et compte les cellules. Tu sauras alors que la banque est vivante, au lieu de l’espérer. Comptage cellulaire pro — en savoir plus →
Les tubes de glycérol ressemblent à de la nourriture mais n'en sont pas. Étiquette la boîte clairement pour que personne d'autre n'y touche.
Étape 4 — Réveille une souche
- Sors un seul tube et referme le congélateur tout de suite — les autres ne doivent pas commencer à dégeler sur les bords.
- Décongèle le tube rapidement dans la main ou dans de l'eau tiède, juste jusqu'à ce que le contenu soit liquide. Ne le laisse pas se réchauffer.
- Verse tout le contenu dans un petit starter stérile, ~100 ml de moût léger (env. 1.020–1.030), à température ambiante.
- Patience : une culture congelée peut demander 24 à 72 heures avant que quoi que ce soit se manifeste. Ne condamne pas le tube trop tôt.
- Une fois qu'elle démarre : monte jusqu'à une quantité ensemençable en suivant le protocole de starter.
- Bâtir une culture de levure — monter jusqu'à ensemençable →
- Calcule les paliers dans le calculateur d'ensemencement →
Profite d'une culture saine en route pour renflouer la banque : congèle de nouveaux tubes de la même souche et note une nouvelle génération sur l'étiquette.
Un tube décongelé ne se recongèle jamais. Les cycles gel-dégel tuent la levure plus vite que tout le reste dans ce protocole.