La misma lección, con las figuras en movimiento.
Conservar cepas
¿Por qué congelar una cepa?
No es una lección que necesites en cada elaboración. Pero merece una tarde el día que tengas una cepa que no quieras arriesgarte a perder — una levadura salvaje bien capturada, una cepa que se ha vuelto difícil de encontrar, o sencillamente tu favorita.
1. El crioprotector
El agua que se congela sin protección forma agujas de hielo cristalinas y afiladas. Crecen atravesando la membrana celular y revientan la célula desde dentro — la levadura no muere de frío, muere por el hielo.
El glicerol resuelve el problema penetrando en la célula y bajando el punto de congelación. El líquido no cuaja entonces en un bloque duro de cristales, sino en una masa viscosa y vítrea, sin aristas cortantes. Las estructuras internas de la célula pasan todo el invierno en el congelador sin daño.
El protocolo usa una solución de glicerol al 40 % mezclada 1:1 con slurry espeso, lo que da alrededor del 20 % en el vial terminado — la concentración con mejor supervivencia celular sin llegar a ser tóxica para la levadura.
2. Esterilizar la solución
Mezcla 40 ml de glicerol (50 g) + 60 ml de agua en una botella de vidrio — eso da una solución de glicerol al 40 %. Enrosca el tapón sin apretar.
El glicerol es viscoso y se queda pegado a la probeta. Pésalo en lugar de medir el volumen: 1 ml de glicerol pesa unos 1,26 g.
Procesa 15 minutos a 121 °C en la olla a presión y deja enfriar a temperatura ambiente con el tapón puesto. ¿No tienes olla a presión? Hierve la botella 20 minutos al baño maría con el tapón flojo — protección más débil, usa la olla si la tienes.
La solución se conserva meses en el frigorífico, así que prepara toda la tanda de una vez.
3. Llenar el criovial
Esteriliza los viales de antemano (en la olla a presión, vacíos y con el tapón flojo) o usa crioviales estériles de fábrica. Desenrosca el tapón y pon el vial en una gradilla — nunca lo sostengas en la mano mientras dosificas.
Añade 0,5 ml de slurry espeso y 0,5 ml de la solución al 40 % — partes iguales, que dan ese 20 por ciento. Un mililitro en total en un vial de 2 ml: buen margen frente al límite del protocolo de dos tercios como máximo, porque el líquido se expande al congelarse.
Da la vuelta al vial varias veces y déjalo reposar 15–30 minutos a temperatura ambiente. El glicerol necesita ese tiempo para penetrar en las células — saltarte el reposo es congelar células sin protección.
Etiqueta el vial con cepa, fecha y generación con un rotulador resistente al frío. Un vial da un despertar más adelante, así que cuenta con 8–10 viales por cepa para años de reserva.
4. El congelador
Coloca los viales en el congelador a −18 a −20 °C y no los vuelvas a tocar. Al fondo del todo y abajo del todo la temperatura es más estable — nunca en la puerta.
Su ciclo de descarche hace oscilar la temperatura, y cada oscilación construye cristales de hielo nuevos en el vial. Un congelador manual, sin descarche automático, es mucho mejor — si solo tienes uno no frost, mete los viales en una caja aislante (nevera portátil, poliestireno) dentro del congelador para amortiguar las oscilaciones.
Cuenta con varios años de conservación a −18/−20 °C. Los −80 °C de un laboratorio son otra liga (décadas), pero un congelador doméstico normal sobra para una biblioteca casera.
Etiqueta bien la caja — los viales de glicerol parecen comida, pero no lo son.
5. Despertar una cepa
Saca un solo vial y cierra el congelador enseguida — los demás no deben empezar a descongelarse por los bordes.
Descongélalo rápido en la mano o en agua tibia, solo hasta que el contenido se vuelva líquido. No lo dejes ahí calentándose.
Vierte todo el contenido en un pequeño starter estéril — unos 100 ml de mosto flojo (1.020–1.030), a temperatura ambiente. Nada de sembrar en placa: la levadura capturada va directa al líquido, donde puedes ver que está viva.
Ten paciencia. Un cultivo congelado puede tardar 24–72 horas antes de que se vea nada — no descartes el vial demasiado pronto. Una vez arrancado, lo escalas como cualquier otro starter.
Los ciclos de congelación y descongelación matan levadura más rápido que ninguna otra cosa de este proceso. Si tienes reserva de sobra: congela viales nuevos la próxima vez que tengas un cultivo sano en marcha, con el siguiente número de generación en la etiqueta.