Dieselbe Lektion, mit bewegten Abbildungen.
Zellzählung mit dem Mikroskop (Neubauer-improved)
Zähl genau, wie viele Zellen du hast (Zellen/mL) und wie viele leben (Viabilität %) — so weißt du präzise, wie viel Hefe du anstellen musst. Verwendet eine Neubauer-improved Zählkammer und Methylenblau. Funktioniert für eine Aufschlämmung und einen fertigen Starter.
Material
- Neubauer-improved Zählkammer (Hämocytometer) + zugehöriges Deckglas
- Mikroskop (100–400×)
- Präzisionspipette (Mikropipette)
- Reagenzglasständer mit mindestens 3 Röhrchen (für die Verdünnungsschritte)
- Destilliertes oder abgekochtes, abgekühltes Wasser (Verdünnungsmittel)
- Methylenblau-Lösung (0,01–0,1 %)
- Handzähler
- Fusselfreie Tücher + Desinfektionsmittel
- Hefeprobe (homogenisierte Aufschlämmung oder Starter)
Bevor du beginnst
- Reinig Zählkammer und Deckglas mit einem fusselfreien Tuch — keine Fingerabdrücke oder Staub auf dem Gitter.
- Homogenisier die Hefeprobe gut (schwenken/schütteln), damit die Zellen gleichmäßig verteilt sind — sonst stimmt die Zählung nicht.
Asepsis ist hier nicht kritisch (du kultivierst die Probe nicht), aber saubere Geräte und Röhrchen ergeben eine sauberere Zählung.
Schritt 1 — Probe verdünnen
- Verdünn in sauberen Röhrchen aus dem Ständer. Dicke Aufschlämmung: 1:100 (1 Teil Probe + 99 Teile Wasser). Dünner Starter: vielleicht 1:10.
- Ziel darauf, dass das zentrale große Quadrat ~100–200 Zellen enthält (~4–8 pro mittlerem Quadrat) — zu dicht ist unlesbar, zu spärlich statistisch unsicher.
- Notier deinen Verdünnungsfaktor (z. B. 1:100 → Faktor 100). Du brauchst ihn für die Berechnung.
Pipettier genau — die Verdünnung ist die größte Fehlerquelle der ganzen Methode.
Schritt 2 — Färben (Viabilität)
- Gib einen Tropfen Methylenblau zur verdünnten Probe und misch vorsichtig. Warte 1–2 min.
- Lebende Zellen stoßen den Farbstoff aus und bleiben klar; tote nehmen ihn auf und werden blau.
- Viabilität vs Vitalität — mehr lesen →
Warte nicht zu lange — nach einer Weile nehmen auch lebende Zellen den Farbstoff auf und die Viabilität wird unterschätzt.
Schritt 3 — Kammer befüllen
- Leg das Deckglas über das Gitter. Berühr mit der Pipettenspitze den Rand des Deckglases und lass die Kapillarkraft ~10 µL einsaugen. Nicht überfüllen — Flüssigkeit in den Kanälen, nicht überschwemmt.
- Lass es ~3 min stehen, damit sich die Zellen in die Fokusebene setzen.
Schritt 4 — Zählen
- Fokussier auf das zentrale große Quadrat (1 mm², 25 mittlere Quadrate) bei 100–400×.
- Randregel: zähl Zellen, die die obere und linke Linie des Quadrats berühren (grün ✓), aber NICHT die, die die untere und rechte berühren (rot ✗) — so zähl nicht doppelt.
- Knospen: eine Knospe zählt als eigene Zelle, wenn sie mindestens drei Viertel so groß wie die Mutterzelle ist, sonst als eine Zelle.
- Klick lebende (klare) und tote (blaue) getrennt. Ziel auf ≥100 Zellen insgesamt für gute Statistik.
Schritt 5 — Berechnen
- Zellen/mL = Zellen im zentralen großen Quadrat × 10 000 × Verdünnungsfaktor. (Bsp.: 120 Zellen bei 1:100 → 120 × 10 000 × 100 = 1,2 × 10⁸ = 120 Millionen Zellen/mL.)
- Viabilität % = lebende / (lebende + tote) × 100.
- Gesamtzellzahl = Zellen/mL × Probenvolumen (mL).
- Nur einen Teil der 25 mittleren Quadrate gezählt? Skalieren: Zellen/mL = (Zellen / gezählte mittlere Quadrate) × 25 × 10 000 × Verdünnung.
- Den Anstellrechner rechnen lassen → unter Gemessen (Zählkammer) — trag lebende, tote, gezählte Quadrate und Verdünnung ein, dann füllen sich Zellen/mL und Viabilität von selbst. Er erledigt auch Schritt 6 — er vergleicht mit deinem Ziel und sagt dir, wie viele mL du anstellen sollst.
Schritt 6 — Mit deiner Anstellmenge vergleichen
- Schlag deine Ziel-Zellzahl im Anstellrechner nach (Sudvolumen × OG × Pitch Rate) und vergleich mit deiner Gesamtzahl.
- Berücksichtige die Viabilität — stell nach lebenden Zellen an (Gesamtzellen × Viabilität %).
Methylenblau überschätzt die Viabilität, am stärksten, wenn sie niedrig ist – unter etwa 90 % (klassische Heim-Methode). Methylenviolett ist genauer, aber schwerer zu bekommen.