La même leçon, avec les figures en mouvement.
Comptage cellulaire au microscope (Neubauer-improved)
Compte exactement combien de cellules tu as (cellules/mL) et combien sont vivantes (viabilité %) — pour savoir précisément combien de levure ensemencer. Utilise une cellule de comptage Neubauer-improved et du bleu de méthylène. Fonctionne pour un culot comme pour un pied de cuve fini.
Matériel
- Cellule de comptage Neubauer-improved (hémocytomètre) + sa lamelle
- Microscope (100–400×)
- Pipette de précision (micropipette)
- Portoir avec au moins 3 tubes (pour les étapes de dilution)
- Eau distillée ou bouillie et refroidie (diluant)
- Solution de bleu de méthylène (0,01–0,1 %)
- Compteur manuel
- Chiffons non pelucheux + désinfectant
- Échantillon de levure (culot ou pied de cuve homogénéisé)
Avant de commencer
- Nettoie la cellule de comptage et la lamelle avec un chiffon non pelucheux — pas d'empreintes ni de poussière sur la grille.
- Homogénéise bien l'échantillon (tourner/secouer) pour que les cellules soient réparties uniformément — sinon le comptage est faussé.
L'asepsie n'est pas critique ici (tu ne cultives pas l'échantillon), mais des outils et tubes propres donnent un comptage plus net.
Étape 1 — Diluer l'échantillon
- Dilue dans des tubes propres du portoir. Culot épais : 1:100 (1 part d'échantillon + 99 parts d'eau). Pied de cuve léger : peut-être 1:10.
- Vise à ce que le grand carré central contienne ~100–200 cellules (~4–8 par carré moyen) — trop dense est illisible, trop clairsemé est statistiquement fragile.
- Note ton facteur de dilution (p. ex. 1:100 → facteur 100). Tu en as besoin pour le calcul.
Pipette avec précision — la dilution est la plus grande source d'erreur de toute la méthode.
Étape 2 — Colorer (viabilité)
- Ajoute une goutte de bleu de méthylène à l'échantillon dilué et mélange doucement. Attends 1–2 min.
- Les cellules vivantes rejettent le colorant et restent claires ; les mortes le captent et deviennent bleues.
- Viabilité vs vitalité — en savoir plus →
N'attends pas trop longtemps — au bout d'un moment, même les cellules vivantes captent le colorant et la viabilité est sous-estimée.
Étape 3 — Charger la cellule
- Place la lamelle sur la grille. Touche le bord de la lamelle avec la pointe de la pipette et laisse la capillarité aspirer ~10 µL. Ne remplis pas trop — du liquide dans les canaux, pas inondé.
- Laisse reposer ~3 min pour que les cellules se déposent dans le plan de mise au point.
Étape 4 — Compter
- Fais la mise au point sur le grand carré central (1 mm², 25 carrés moyens) à 100–400×.
- Règle de bordure : compte les cellules qui touchent les lignes supérieure et gauche du carré (vert ✓), mais PAS celles qui touchent l'inférieure et la droite (rouge ✗) — pour ne pas compter deux fois.
- Bourgeons : un bourgeon compte comme une cellule séparée s'il fait au moins les trois quarts de la cellule mère, sinon comme une cellule.
- Clique vivantes (claires) et mortes (bleues) séparément. Vise ≥100 cellules au total pour de bonnes statistiques.
Étape 5 — Calculer
- Cellules/mL = cellules dans le grand carré central × 10 000 × facteur de dilution. (Ex. : 120 cellules à 1:100 → 120 × 10 000 × 100 = 1,2 × 10⁸ = 120 millions de cellules/mL.)
- Viabilité % = vivantes / (vivantes + mortes) × 100.
- Total de cellules = cellules/mL × volume de l'échantillon (mL).
- Tu n'as compté qu'une partie des 25 carrés moyens ? Mets à l'échelle : cellules/mL = (cellules / carrés moyens comptés) × 25 × 10 000 × dilution.
- Laisse le calculateur compter pour toi → sous Mesuré (Hémocytomètre) — saisis les vivantes, les mortes, les carrés comptés et la dilution, et cellules/mL et viabilité se remplissent seules. Il fait aussi l'étape 6 — il compare à ta cible et t'indique combien de mL ensemencer.
Étape 6 — Comparer à ton ensemencement
- Cherche ton nombre de cellules cible dans le calculateur d'ensemencement (volume × DI × taux d'ensemencement) et compare avec ton total.
- Tiens compte de la viabilité — ensemence selon les cellules vivantes (total × viabilité %).
Le bleu de méthylène surestime la viabilité, surtout quand elle est basse – sous environ 90 % (méthode maison classique). Le violet de méthylène est plus précis mais plus difficile à trouver.